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四种主要苹果病毒的荧光定量RT-PCR检测技术

权限:无添加时间:2024-10-09 16:25:00 浏览次数:82

苹果具有独特的营养价值和经济价值，在世界范围内被广泛种植，中国是世界上最大的苹果生产国。苹果病毒病在世界各地分布广泛，且苹果病毒病多为两种甚至两种以上病毒侵染，复合感染率极高。苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）、苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus, ASGV）、苹果茎痘病毒（apple stem pitting virus, ASPV）三种潜隐性病毒以及苹果花叶病毒（apple mosaic virus, ApMV）、苹果坏死花叶病毒（apple necrotic mosaic virus, ApNMV）、苹果锈果类病毒（apple scar skin vrioid, ASSVd）等非潜隐性病毒危害猖獗，大大降低了苹果的产量和品质，除了影响树体生长、叶片变小和果实畸形外，还可导致树势急剧衰退、提早枯死或采前落果，甚至绝产，尤其是果实显症的病害直接影响果实品质，对苹果的生产具有毁灭性的危害。分子生物学检测技术已在病毒诊断及检测领域广泛应用，苹果病毒的检测主要以核酸检测为主，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）相较于其他分子生物学检测技术，具有高效、稳定、耗时短、不易交叉污染等优点，已被用来检测多种果树病毒。

我们基于SYBR GreenＩ实时荧光定量RT-PCR 技术建立了ASGV、ASPV、ApNMV、ASSVd 的检测体系，针对4种病毒各筛选出灵敏度和特异性较高的引物，优化了检测体系和程序，有效提高了4种苹果病毒的检测效率，为苹果病毒病的早期监测与预警提供技术支撑，也为后续的防控效果评价奠定基础。具体的检测技术体系如下：

1、苹果茎痘病毒RT-qPCR 检测体系

1.1 RT-qPCR 扩增体系

20 μL 体系：2×M5 HiPer SYBR Premix Es Taq (with Tli RNaseH)（北京聚合美生物科技有限公司）10 μL、cDNA 1 μL、10 μMASPV-qF（T G T T C C A C C T C C A C C A C C T G T A G）和ASPV-qR（A T G C C C A G C G A A T C T T T C C A A C C）各0.5 μL、ddH₂O 8 μL。

1.2 qPCR 反应程序

赛默飞世尔科技（中国）有限公司Quant Studio™5实时荧光定量PCR 仪进行qPCR 反应，程序为：95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 个循环。

1.3 线性回归方程

线性回归方程为：Cq= -3.3816lgC+ 42.13，扩增效率E为97.56%，相关系数R²为0.9987。

1.4 最低检测限

最低检测限为3.694×10² copies/μL 。

2、苹果坏死花叶病毒检测体系

2.1 RT-qPCR 扩增体系

20 μL 扩增体系：2×M5 HiPer SYBR Premix Es Taq (with TliRNaseH)（北京聚合美生物科技有限公司）10 μL、cDNA 1 μL、10μM ApNMV-qF（C G G A T G G G T G G G A A T G G T A G A G G）和ApNMV-qR（C T C G G T T G G T C T T G G C G G A A A C）各0.5 μL、ddH₂O 8 μL。

2.2 qPCR 反应程序

赛默飞世尔科技(中国)有限公司Quant Studio™5实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应，程序为95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，40个循环。

2.3 线性回归方程

线性回归方程Cq=-3.3088lgC+ 40.215 ，扩增效率E为100.55%，相关系数R²为0.9988，结果表明使用该方法建立的标准曲线可信。

2.4 最低检测限

该方法最低检测限为1.328×10-¹ copies/μL。

3、苹果茎沟病毒检测体系

3.1 RT-qPCR 扩增体系

qPCR 体系：20 μL 扩增体系：2×M5 HiPer SYBR Premix Es Taq(with Tli RNaseH)（北京聚合美生物科技有限公司）10 μL、cDNA1 μL、10 μM ASGV-qF-1（T C T G C C T A G A A G T G G C A G C A）和ASGV-qR-1（A A A G A A G G C C A G A G C G G G T T）各0.5 μL、ddH₂O 8 μL。

3.2 qPCR 反应程序

赛默飞世尔科技(中国)有限公司Quant Studio™5实时荧光定量PCR仪进行qPCR反应，程序为95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 个循环。

3.3 线性回归方程

ASGV 质粒建立的线性回归方程为Cq= -3.1646lgC+36.356，相关系数R² 为0.9966，扩增效率E为107.01%，结果表明使用该方法建立的标准曲线可信。

3.4 最低检测限

该方法最低检测限为8.26×10¹ 拷贝/μL。

4、苹果锈果类病毒RT-qPCR 检测体系

4.1 RT-qPCR 扩增体系

qPCR 体系：20 μL 扩增体系：FastStart Essential DNA Green Master 10 μL、cDNA 1 μL、10 μmol/L ASSVdR2-F/R 引物（F: T G T G G G T T C G C C T A C A A G A A; R: A A A G A G C G T G A G A G A A C A G G）各1 μL、2×ddH₂O 7 μL。

4.2 qPCR 反应程序

LightCycler® 96 实时荧光定量PCR 仪进行qPCR 反应，反应程序为95℃预变性30 s；95℃变性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸10 s，40 个循环。72℃再延伸10 min。

4.3 线性回归方程

标准曲线方程为y=-2.646x+65.170，相关系数R²=0.991，说明标准曲线重复性好。

4.4 最低检测限

用健康组织RNA溶液对果皮、须根、枝皮提取的总RNA进行系列稀释并进行RT-qPCR，结果表明检测灵敏度分别为41.00、20.44、14.94 fg/μL，根据公式计算灵敏度分别相当于5.95×105、2.97×105、2.17×105 copies/μL RNA。